Calmodulin/KCa3.1 channel interactions as determinant to the KCa3.1 Ca2+ dependent gating : theoretical and experimental analyses

Differentes etudes ont montre que la sensibilite au Ca2+ du canal KCa3.1, un canal potassique independant du voltage, etait conferee par la proteine calmoduline (CaM) liee de facon constitutive au canal. Cette liaison impliquerait la region C-lobe de la CaM et un domaine de $\ikca$ directement relie au segment transmembranaire S6 du canal. La CaM pourrait egalment se lier au canal de facon Ca2+ dependante via une interaction entre un domaine de KCa3.1 du C-terminal (CaMBD2) et la region N-lobe de la CaM. Une etude fut entreprise afin de determiner la nature des residus responsables de la liaison entre le domaine CaMBD2 de KCa3.1 et la region N-lobe de la CaM et leur role dans le processus d'ouverture du canal par le Ca2+. Une structure 3D du complexe KCa3.1/CaM a d'abord ete generee par modelisation par homologie avec le logiciel MODELLER en utilisant comme reference la structure cristalline du complexe SK2.2/CaM (PDB: 1G4Y). Le modele ainsi obtenu de KCa3.1 plus CaM prevoit que le segment L361-S372 dans KCa3.1 devrait etre responsable de la liaison dependante du Ca2+ du canal avec la region N-lobe de la CaM via les residus L361 et Q364 de KCa3.1 et E45, E47 et D50 de la CaM. Pour tester ce modele, les residus dans le segment L361-S372 ont ete mutes en Cys et l'action du MTSET+ (charge positivement) et MTSACE (neutre) a ete mesuree sur l'activite du canal. Des enregistrements en patch clamp en configuration ``inside-out`` ont montre que la liaison du reactif charge MTSET+ au le mutant Q364C entraine une forte augmentation du courant, un effet non observe avec le MTSACE. De plus les mutations E45A et E47A dans la CaM, ont empeche l'augmentation du courant initie par MTSET+ sur le mutant Q364C. Une analyse en canal unitaire a confirme que la liaison MTSET+ a Q364C cause une augmentation de la probabilite d'ouverture de KCa3.1 par une destabilisation de l'etat ferme du canal. Nous concluons que nos resultats sont compatibles avec la formation de liaisons ioniques entre les complexes charges positivement Cys-MTSET+ a la position 364 de KCa3.1 et les residus charges negativement E45 et E47 dans la CaM. Ces donnees confirment qu'une stabilisation electrostatique des interactions CaM/KCa3.1 peut conduire a une augmentation de la probabilite d'ouverture du canal en conditions de concentrations saturantes de Ca2+.