Molecular imaging of tumors with nanobodies and antibodies: Timing and dosage are crucial factors for improved in vivo detection

The utility of nanobodies and conventional antibodies for in vivo imaging is well known, but optimum dosing and timing schedules for one versus the other have not been established. We aimed to improve specific tumor imaging in vivo with nanobodies and conventional antibodies using near-infrared fluorescence (NIRF) imaging. We used ARTC2 expressed on lymphoma cells as a model target antigen. ARTC2-specific nanobody s+16a and conventional antibody Nika102 were labeled with NIRF-dye AF680. In vivo NIRF-imaging of ARTC2-positive and ARTC2-negative xenografts was performed over 24 h post-injection of 5, 10, 25, or 50 μg of each conjugate. Specific target-binding and tissue-penetration were verified by NIRF imaging ex vivo, flow cytometry and fluorescence microscopy. NIRF imaging of s+16a680 in vivo revealed a six times faster tumor accumulation than of Nika102680. Using 50 μg of s+16a680 increased the specific signals of ARTC2-positive tumors without increasing background signals, allowing a tumor-to-background (T/B) ratio of 12.4 ± 4.2 within 6 h post-injection. Fifty micrograms of Nika102680 increased specific signals of ARTC2-positive tumors but also of ARTC2-negative tumors and background, thereby limiting the T/B-ratio to 6.1 ± 2.0. Ten micrograms of Nika102680 only slightly reduced specific tumor signals but dramatically reduced background signals. Ex vivo analyses confirmed a faster and deeper tumor penetration with s+16a680. Using nanobody s+16a allowed same-day imaging with a high T/B-ratio, whereas antibody Nika102 gave optimal imaging results only 24 h post injection. Nanobody s+16a required a high dose, whereas antibody Nika102 had the best T/B-ratio at a low dose. Therefore, timing and dosage should be addressed when comparing nanobodies and conventional antibodies for molecular imaging purposes. Der Nutzen von Nanobodies und konventionellen Antikorpern fur die in vivo Bildgebung ist bekannt. Jedoch sind in der Anwendung weder optimale Dosierungen noch Zeitablaufe etabliert. Wir haben uns zum Ziel gesetzt, die spezifische in vivo Nah-Infrarot-Fluoreszenzbildgebung (NIRF) von Tumoren mittels Nanobodies und konventionellen Antikorpern zu optimieren. Als Modell-Antigen haben wir das auf Lymphomzellen exprimierte ARTC2 verwendet. Der ARTC2-spezifische Nanobody s+16a und der konventionelle Antikorper Nika102 wurden mit dem NIRF-Farbstoff AF680 konjugiert. Nach Injektion von jeweils 5, 10, 25 oder 50 μg jedes Konjugats wurden in vivo NIRF-Bildgebungsversuche mit ARTC2-positiven und negativen Xenografts uber einen Zeitraum von 24 h durchgefuhrt. Die spezifische Bindung an Zielstrukturen und Gewebsdurchgangigkeit wurden mittels ex vivo NIRF-Bildgebung, Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie verifiziert. NIRF-Bildgebung in vivo von s+16a680 zeigte eine sechsfach schnellere Tumoranreicherung im Vergleich zu Nika102680. Durch die Verwendung von 50 μg s+16a680 liesen sich die spezifischen Signale der ARTC2-positiven Tumoren steigern, ohne unspezifische Hintergrundsignale zu erhohen. So konnte ein Tumor-zu-Hintergrund (T/B) Verhaltnis von 12.4 ± 4.2 innerhalb von 6 h erreicht werden. Funfzig μg von Nika102680 erhohten das spezifische Tumorsignal von ARTC2-positiven Tumoren, bei jedoch gleichzeitiger Erhohung des Signals der ARTC2-negativen Tumoren und des Hintergrundsignals. Dadurch ergab sich ein reduziertes T/B-Verhaltnis von nur 6.1 ± 2.0. Der Einsatz von 10 μg Nika102680 hatten nur eine geringe Reduktion des spezifischen Signals zu folge, konnten jedoch das Hintergundsignal drastisch reduzieren. Die ex vivo Analyse konnten eine schnellere und tiefere Tumorpenetration mit s+16a680 bestatigen. Der Nanobody s+16a ermoglichte Bildgebung am Injektionstag mit einem hohen T/B-Verhaltnis, wohingegen der Antikorper Nika102 die besten Ergebnisse erst 24 h nach Injektion zeigte. Der Nanobody s+16a benotigte hohe Dosen, wohingegen der Antikoper Nika102 die T/B-Verhaltnisse mit niedrigen Dosen erzielen konnte. Eine Anpassung der Dosis und Zeitablaufe ist daher essentiell fur vergleichende Versuche mit Nanobodies und konventionellen Antikorpern in der molekularen Bildgebung.