Isolation of caveolae using affinity two-phase partitioning

Popular Abstract in Swedish Malsattningen for detta arbete var att isolera caveolae for att kunna studera deras struktur och funktion. Caveolae ar omegaformade inbuktningar i cellmembranet, ungefar 50-150 nm i diameter. Caveolae finns i manga typer of celler, men inte i roda och vita blodkroppar eller nervceller. Man tror att de har flera viktiga funktioner. Exempelvis kan caveolae transportera molekyler mellan olika regioner av cellmembranet och aven till membraner inne i cellen. Caveolae ar ocksa ett viktigt element i overforingen av signaler fran cellens omgivning till dess inre. An sa lange vet man inte om caveolae utfor liknande funktioner i olika organ i kroppen eller om funktionerna skiljer sig at. Den vanliga isoleringsmetoden for caveolae ar baserad pa att losgora dem fran isolerade cellmembraner och sedan rena dem genom centrifugering i tathetsgradienter. Caveolae karakteriseras med hjalp av caveolin som ar ett protein som finns i caveolaemembranet. Kolesterol och sfingolipider ar viktiga lipider i detta membran, vilket gor det olosligt i vissa detergenter. Detta utnyttjas for att losa ut caveolae fran andra delar av cellmembranet. Isolerade cellmembraner anvands som startmaterial for att rena caveolae. Har har en alternativ metod anvants som gar ut pa att rena membranerna i s.k. tvafassystem. Ett tvafassystem bestar av tva polymerlosningar i vatten som inte ar blandbara. Dessa losningar bildar tva faser ungefar som olja och vatten. Olika membraner fordelar sig olika i ett sadant tvafassystem och kan separeras fran varandra pa det sattet. For att forbattra reningen av cell membraner har ett sockerbindande protein, ett s.k. lektin som isolerats fran vetegroddar, kopplats till den ena faspolymeren. Eftersom lektiner binder till sockerrester som finns pa ytan av cellmembranet styr man cellmembranet till den fas som innehaller lektinet. Proceduren kallas affinitetsrening. Caveolae kan sedan losas ut fran cellmembranet med detergenter. For att rena caveolae har en ny metod utarbetats som ocksa bygger pa tvafasseparation och affinitetsfordelning. Har anvands antikroppar som kanner igen caveolinet i caveolae for att styra caveolae till en av faserna i tvafassystemet. Affinitetsfordelning ar en bra och snabb metod for rening av caveolae. Metoden kan ocksa utnyttjas for isolering av andra membraner genom att byta till antikroppar som ar riktade mot ytproteiner i dessa membraner. Vi har alltsa utvecklat alternativa tekniker for att isolera cellmembraner och caveolae for att kunna studera caveolaes exakta roll i celler. Exempelvis kan man studera sadana transportmekanismer i caveolae som utnyttjas av malaria- och somnsjukeparasiter for att ta sig in i cellen. Aven koleratoxin tas upp pa samma satt. Det ar darfor av intresse att rena caveolae for att kunna studera deras funktioner och darmed forsoka lara sig styra sadana transportmekanismer. (Less)