BB. Identificação de sequências-alvo no genoma do vírus da Dengue para desenvolvimento de Ribossensores

Introducao: A Dengue e uma doenca causada pelo virus da Dengue, um virus de RNA que infecta cerca de 390 milhoes de pessoas por ano no mundo todo. Atualmente, o tratamento desta doenca e sintomatico devido a ineficacia dos medicamentos antivirais, e o diagnostico preciso do virus depende de procedimentos laboratoriais demorados e caros. Uma alternativa e o desenvolvimento de um kit diagnostico baseado em um sistema de expressao in vitro composto pelos componentes comumente encontrados em kits comerciais de transcricao e traducao extraidos de E. coli. O DNA molde para a reacao contem o gene reporter amilCP (cromoproteina azul) sob controle de um promotor forte e de um RNA regulatorio do tipo Toehold Switch, capaz de detectar a presenca do RNA viral. Este sistema e composto de duas fitas de RNA denominadas switch e trigger. Na primeira, encontram-se a sequencia codificadora do gene reporter, a sequencia conectora e a sequencia de ancoragem que servira para o pareamento inicial do RNA trigger. Este ultimo e uma sequencia de RNA fita simples capaz de ligar-se ao RNA switch, desestruturar o hairpin, e expor as sequencias do RBS e do codon inicial para a transcricao do gene reporter ser ativada. Objetivo: Este trabalho visa o desenvolvimento de sensores de RNA para identificacao do virus dengue que possibilitem a criacao de um metodo para diagnostico simples e rapido para a doenca. Metodologia: Os genomas dos quatro sorotipos da dengue foram alinhados com os genomas da Zika e Chikungunya e entao escolhidas tres sequencias-alvo do RNA do virus da Dengue de aproximadamente 40 nucleotideos que foram utilizadas como sequencias de ancoragem para construcao dos sistemas de Toehold switch. Os sistemas foram desenhados in silico usando o software NUPACK. As sequencias projetadas foram compradas como oligonucleotideos de DNA fita simples, aneladas, clonadas sob controle do promotor T7 por reacao ciclica da ligase (LCR - Ligase Cycling Reaction) e fusionadas ao gene reporter. A funcionalidade do RNA switch sera testada contra sequencias sinteticas correspondentes aos RNAs virais delimitados como sequencias-alvo. Reacoes de transcricao e traducao in vitro serao montadas com uma versao do RNA switch em plasmideo mais o RNA-alvo sintetico. O resultado positivo sera identificado pela alteracao de cor na reacao devido a sintese da cromoproteina azul. Resultados e discussao: As sequencias-alvo do RNA viral da Dengue escolhidas sao significativamente diferentes dos genomas da Zika e Chikungunya, mas identicas entre os quatro sorotipos da Dengue, apresentando baixa taxa de mutacao. Isto permitiu o desenvolvimento de RNAs switch altamente especificos para a doenca, independente de seu sorotipo. Os resultados preliminares indicaram sucesso na transformacao das celulas de E. coli TOP10 com o plasmideo contendo o RNA switch a ser testado. Conclusao: O trabalho esta em fase inicial e poucos resultados foram obtidos, porem, ao que tudo indica, os sensores de RNA apresentam alto potencial como metodo diagnostico.