氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸对破骨细胞自噬和分化的影响

为了探究氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）对破骨细胞自噬及分化能力的影响，以BALB/c小鼠骨髓巨噬细胞诱导分化形成的破骨细胞为研究对象，添加0.5 mmol·mL-1AICAR（AMPK激活剂）处理4 h后，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鉴定破骨细胞；CCK-8法检测破骨细胞存活率；高内涵系统分析TRAP+细胞比率、面积、荧光强度及圆度；蛋白免疫印迹（Western blot）和荧光定量聚合酶链式反应方法（qRT-PCR）检测AMPK、NFATc1、c-Fos、CTSK、TRAP、（LC3-Ⅱ）、ATG5、Beclin1、p62的mRNA和蛋白水平；激光共聚焦显微镜观察EGFP-pmCherry-LC3荧光聚点。结果显示，通过30 ng·mL-1M-CSF和60 ng·mL-1RANKL诱导分化4 d的细胞TRAP染色后大部分呈阳性且细胞核数目≥3。AICAR处理后，与对照组相比，细胞存活率无显著差异（P>0.05），但细胞面积、TRAP+（细胞核数目≥3）细胞率、TRAP荧光强度显著下降（P < 0.05）。AICAR组破骨细胞c-Fos、TRAP（P < 0.01）、p62（P < 0.05）的mRNA水平显著下降，LC3、ATG5的mRNA水平显著升高（P < 0.05）。AICAR处理致AMPKα蛋白磷酸化水平极显著升高（P < 0.01），NFATc1、c-Fos、CTSK、p62（P < 0.01）和TRAP（P < 0.05）蛋白表达量显著下调，LC3-Ⅱ、ATG5和Beclin1蛋白表达水平极显著上调（P < 0.01）。转染LC3质粒结果显示AICAR处理后LC3黄色及红色荧光聚点数目增多，绿色荧光聚点数目减少。结果表明0.5 mmol·mL-1AICAR作用4 h可激活破骨细胞AMPKα，增强破骨细胞的自噬水平，但抑制了破骨细胞的分化。