Teste de funcionalidade de Ribossensores sintéticos desenvolvidos para identificação do vírus da Dengue

Introducao: O virus da Dengue e um virus de RNA que infecta cerca de 390 milhoes de pessoas por ano e representa risco de infeccao para mais de tres bilhoes de pessoas.Porem a doenca possui sintomatologia inespecifica, dificultando seu diagnostico. Assim, este estudo propoe um kit diagnostico para o virus baseado em um sistema de expressao in vitro composto pelos componentes comumente encontrados em kits comerciais de transcricao e traducao extraidos de E. coli. O DNA molde para a reacao contemo gene reporterda enzima luciferase sob controle de um promotor forte e de um RNA regulatorio do tipo Toehold Switch, capaz de detectar a presenca do RNA viral. Este sistema e composto de duas fitas de RNA denominadas switch e trigger. Na primeira, encontram-se a sequencia codificadora do gene reporter, a sequencia conectora e a sequencia de ancoragem que servira para o pareamento inicial do RNA trigger. Este ultimo e uma sequencia de RNA fita simples capaz de ligar-se ao RNA switch, desestruturar o hairpin, e expor as sequencias do RBS e do codon inicial para a transcricao do gene reporter ser ativada. Objetivo: Desenvolvimento de sensores de RNA para identificacao do virus dengue que possibilitem a criacao de um metodo para diagnostico simples e rapido para a doenca. Metodologia: A partir da construcao in silico dos sistemas Toehold switch contendo as sequencias alvo do genoma do virus da Dengue,os mesmos (DENV10550Switch(1) e DENV10550Switch(2)) foram adquiridas na forma de DNA fita simples, aneladas eclonadas em plasmideo contendo o gene reporter luciferase, utilizando tecnicas usuais de biologia molecular. A funcionalidade do RNA switch foi testada contra sequencias sinteticas correspondentes ao RNA viral da Dengue delimitado como sequencias-alvo (sequencia especifica) e RNA viral da Zika (sequencia inespecifica). Reacoes de transcricao e traducao in vitroforam montadas com uma versao do RNA switch em plasmideo mais o RNA viral especifico e comparadas a reacao com o RNA viral inespecifico. O resultado positivo e identificado pela luminescencia emitida pela enzima luciferase na presenca de seu substrato. Resultados e discussao:Apos o teste em diferentes proporcoes (ng/ng) de DNAplasmidial:RNA trigger, os maiores sinais de ativacao da expressao foram obtidos com a proporcao 5:500 para os dois sistemas DENV10550Switch(1) e DENV10550Switch(2)na presenca do RNA trigger especifico, que apresentaram um aumento da expressao do gene reporter de 6,9±0,4 e 11,4±3,0 vezes, respectivamente, em relacao aos valores obtidos para o RNA trigger inespecifico. Estes valores demonstram a especificidade dos sistemas criados, que sao capazes de identificar 3,6μM de RNA viral sintetico da Dengue. Conclusao: Os sistemas Toehold switch construidos mostraram-se especificos e funcionais: detectam o RNA sintetico do virus da Dengue e resultam em um aumento da expressao do gene reporter. O sistema e promissor para diagnostico do virus da Dengue e tem potencial para ser melhorado de forma a apresentar maior sensibilidade e especificidade.