miRNA219-5P靶向调控Smad4表达影响TGF-β_1诱导肌腱成纤维细胞纤维化的研究

目的 探讨mi RNA219-5P（mi R219-5P）调控Smad4在TGF-β1诱导人肌腱成纤维细胞（tendon derived fibroblasts,TDFs）纤维化过程中的作用。方法 取患者自愿捐赠的肌腱组织分离培养TDFs,取第3代细胞进行实验。化学合成mi R219-5P类似物（mimics）、阻遏物（inhibitor）及阴性对照序列,分别转染TDFs 48 h后,采用实时定量PCR及Western blot法分别检测mi R219-5P基因及Smad4蛋白表达情况;以正常细胞作为空白对照。信息学软件预测mi R219-5P与Smad4基因3’UTR区结合位点,构建Smad4预测基因3’UTR-PGL3重组质粒,构建野生型及突变型报告基因表达载体,并通过荧光素酶报告基因实验进行靶位验证。取正常及转染后TDFs,采用TGF-β1诱导细胞发生纤维化,于培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活性变化,72 h时采用Western blot法检测纤维化相关蛋白指标。结果 mi R219-5P mimics转染TDFs可明显上调mi R219-5P表达、下调Smad4蛋白表达,而mi R219-5P inhibitor抑制细胞内mi R219-5P表达、增加Smad4蛋白表达,与空白对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。荧光素酶实验显示,与p GL3-WT-Smad4转染组比较,p GL3-WT-Smad4＋mimics转染组细胞内荧光素酶活性降低、p GL3-WT-Smad4＋inhibitor转染组活性增强（P〈0.05）;而p GL3-MT-Smad4＋mimics转染组、p GL3-MT-Smad4＋inhibitor转染组组间比较无明显变化（P〉0.05）。与空白对照组比较,TGF-β1诱导培养72 h后细胞增殖活性明显增强（P〈0.01）,同时上调细胞纤维化相关蛋白指标的表达（P〈0.01）;与直接诱导组比较,mi R219-5P过表达且诱导组TDFs细胞增殖活性和纤维化蛋白指标升高趋势得到抑制,而mi R219-5P表达抑制且诱导组细胞增殖活性和纤维化蛋白指标则进一步增强,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 mi R219-5P可通过抑制其靶基因Smad4表达,显著抑制TGF-β1诱导TDFs纤维化。