Evaluation of therapeutic sensitivity of retinal ganglion cells to targeted peptide bioregulator in culture

: Цель - изучить терапевтическую чувствительность культуры клеток сетчатки к пептидному биорегулятору, выделенному из сетчатки крупного рогатого скота (Ретиналамин), при моделировании глаукомной оптиконейропатии. Материал и методы. Клетки выделяли из изолированных сетчаток новорожденных мышей. Клеточные пласты дезагрегировали и переводили в форму суспензии. Для удаления нецелевых популяций добавляли антитела для деплеции клеток с маркером CD48 и вносили связывающиеся с ними магнитные антибиотиновые микросферы. Для селекции ганглиозных клеток и получения их обогащенной фракции проводили иммуномагнитную сепарацию. Для проверки токсичности препарата на культуре фибробластов кожи провели цитотоксический тест с разведениями Ретиналамина в концентрациях 5,0-0,009 мг/мл. Клетки рассевали в концентрации 5000 на лунку и экспонировали с препаратом 24 ч. Для изучения эксайтотоксического повреждения в 1-ю группу лунок с клетками сетчатки вносили раствор глутамата натрия до концентрации 20 мМ, во 2-ю группу - Ретиналамин в концентрации 1,25 мг/мл, в 3-ю - оба вещества. Интактные лунки были контрольными. Экспозиция с тестируемыми субстанциями длилась 24 ч. Далее оценивали жизнеспособность клеток колориметрическим методом. Оптическую плотность измеряли автоматическим фотометром с длиной волны детекции 490 нм. Результаты. Полученная в результате иммуномагнитной сепарации культура является смешанной и представлена ганглиозными и глиальными клетками. Ретиналамин не обладает значимой токсичностью ни в одной из исследованных концентраций. Эксайтотоксическое повреждение вызвало значимое снижение количества жизнеспособных клеток в культуре (9% от контроля). При совместном внесении глутамата и Ретиналамина в его конечной концентрации 1,25 мг/мл количество выживших клеток возросло до 51,6%. Межгрупповые различия статистически значимы при использовании критерия Стьюдента. Заключение. Ретиналамин не обладает цитотоксичностью. При совместном внесении глутамата и Ретиналамина токсическое действие первого на выделенные клетки сетчатки достоверно снижается. MATERIAL AND METHODS: The cells were isolated from the retinae separated from newborn mice. Cell sheets were disaggregated and transformed into a suspension. Removal of the off-target cell population was done by adding antibodies to deplete the cells with CD48 marker, and magnetic microbeads that attach to them. Selection of ganglion cells and obtainment of its enriched fraction was done by immunomagnetic separation. To assess the toxicity of Retinalamin, a cytotoxic test was performed on the culture of skin fibroblasts with sequential dilution of the drug into concentrations of 5.0-0.009 mg/mL. The cells were seeded at 5000 per plate well and exposed to the drug for 24 hours. To study the excitotoxic damage, the first group of plate wells with retinal cells had solution of sodium glutamate added in concentration of 20 mM, Retinalamin was added into the second group of wells in concentration of 1.25 mg/mL; both substances were added into the third group of wells. The control group consisted of intact plate wells. The cells were exposed to substances for 24 hours. Cell vitality was then evaluated using colorimetry. Optic density was measured using an automatic photometer with detection wavelength of λ=490 nm. RESULTS: The cell culture achieved by immunomagnetic separation is mixed and consists of ganglion and glial cells. Retinalamin does not display significant cytotoxicity in any of the studied concentrations. The excitotoxic damage caused significant decrease of the amount of viable cells in the culture (9% of the control wells). The concomitant addition of glutamate and 1.25 mg/mL Retinalamin resulted in a 51.6% increase in the amount of viable cells. The intergroup differences were statistically significant by Student's t-test. CONCLUSION: Retinalamin is not cytotoxic. The concomitant addition of glutamate and Retinalamin reliably decreases the toxic action of glutamate on isolated retinal cells.