Desenvolvimento de sensores sintéticos de RNA para identificação dos vírus da Zika

Introducao: Zika virus e um arbovirus do genero Flavivirus transmitido por mosquitos Aedes, majoritariamente o Aedes aegypti.A doenca causada por este virus pode gerar severas complicacoes, como a Sindrome de Guillain-Barre e microcefalia em recem-nascidos. Ate o momento, os testes diagnosticos sao baseados na identificacao de anticorpos, entretanto, ha a possibilidade de ocorrer reacoes cruzadas com outros flavivirus.A identificacao do Zika virus, neste trabalho, baseia-se em sequencias de RNA regulatorios denominados “Toehold Switches”. O sistema e composto por dois riboreguladores (o switch (interruptor da expressao genica) e o trigger (gatilho da expressao)) e um gene reporter. O gene reporter tem sua expressao interrompida pelo switch, e ativada pelo trigger, o qual, neste projeto, consiste em uma sequencia especifica do genoma do Zika virus. Objetivo: Construcao de um sistema de regulacao de expressao genica altamente especifica, capaz de identificar o RNA viral do Zika. Metodologia: A escolha da sequencia-alvo, para a obtencao do RNA trigger e desenho do switch, foi realizada pela comparacao entre as sequencias dos genomas dos virus da Dengue (quatro sorotipos), Zika e Chikungunya. Atraves do alinhamento dos genomas, selecionou-se sequencias de 40 nucleotideos, unicas do genoma do Zika. A sequencia do switch foi obtida em forma de oligonucleotideos e clonada no plasmideo pT7luc(GCA), de forma que o gene da luciferase foi utilizado como reporter. Com isso, foram realizadas reacoes de transcricao e traducao in vitro, na presenca do RNA trigger especificoena presenca de um RNA trigger inespecifico. Resultados e discussao: As reacoes com RNA trigger especifico e inespecifico nao indicaram a especificidade desejada para a deteccao do RNA do virus da Zika. Com base nos resultados, a sequencia do RNA trigger foi analisada no software NUPACK, o qual possibilita a previsao da interacao entre o RNAswitch e o RNA trigger.A analise indicou a necessidade de otimizacao da sequencia do switch,pois verificou-se que havia a probabilidade de que, mesmo na presenca do RNA trigger, o Sitio de Ligacao do Ribossomo (RBS) continuasse inacessivel, prejudicando a expressao do gene reporter. Assim, realizou-se modificacoes na sequencia do switch que permitissem a liberacao, de maneira adequada, do RBS apos interacao com o trigger. A clonagem do switch modificado,que tambem foi obtido na forma de oligonucleotideos, encontra-se em andamento. Conclusao:Este trabalho mostrou que o processo de design racional de RNAs regulatorios ainda nao pode ser totalmente automatizado, pois depende ainda de um ciclo de construcao-simulacao-experimentacao-aprendizado que restringe o processo de criacao. Ainda assim, temos obtido no grupo SynBio_Araraquara um indice de 90% de sucesso no desenho racional de riborreguladores.