Polymerase chain reaction-based detection of dermatophyte DNA with a fungus-specific primer system

Summary. There is significant clinical interest in primers which are specific for fungi and do not hybridize to DNA of other eukaryotes or prokaryotes. Such primers would allow specific amplification of fungal DNA from human tissue samples containing fungi. Fungal identification to the species level could follow by direct sequencing or restriction analysis. Several previously described primer systems cross-react with DNA of plants and animals. We have designed a primer system that amplifies a fragment of the gene coding for the small ribosomal subunit 18S rRNA. Database searches and sequence analyses were performed using the HUSAR (Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources) computer system at the German Cancer Research Centre, Heidelberg, Germany. Primers TR1 (5′-GTTTCTAGGACCGCCG-TA) and TR2 (5′-CTCAAACTTCCATCGAC-TTG) bind to sequences which are homologous within the fungi, but differ from corresponding DNA fragments of plants and animals. The amplified fragment is 581 base pairs in length and contains variable, and therefore species-specific, regions. The DNA of Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton terrestre, Microsporum canis, Microsporum gypseum and Epidermophyton floccosum and of several yeast species was amplified by the primers, but not the DNA from 42 normal human skin samples. Furthermore, other DNA preparations from plants and animals, including those from radish, cabbage, wheat and mouse, did not show amplification reactions. Zusammenfassung. Es besteht groses klinisches Interesse an Primern, die fur Pilze spezifisch sind und nicht mit DNA von anderen Eukaryonten oder Prokaryonten hybridisieren. Solche Primer wurden die spezifische Amplifikation von Pilz-DNA aus menschlichen Gewebeproben, die Pilze enthalten, erlauben. Die Pilzidentifizierung bis zur Speziesebene konnte folgen—mittels direkter Sequenzierung oder Restriktionsanalyse. Mehrere fruher beschriebene Primersysteme zeigten Kreuzreaktionen mit DNA von Pflanzen und/oder Tieren. Wir entwarfen ein Primersystem, welches ein Fragment des Gens amplifiziert, das fur die kleine ribosomale Untereinheit (18S rRNA) kodiert. Datenbanksuche und Sequenzanalysen wurden mit dem HUSAR (Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources)-Computersystem des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ), Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland, durchgefuhrt. Die Primer TR1 (5′-GTTTCTAGGACCGCC-GTA) und TR2 (5′-CTCAAACTTCCATCGAC-TTG) binden an Sequenzen, die innerhalb der Pilze homolog sind, sich jedoch von korrespondierenden DNA-Abschnitten bei Pflanzen und Tieren unterscheiden. Das amplifizierte Fragment ist 581 Basenpaare lang und enthalt variable, und daher spezies-spezifische Regionen.